ISOLASI DNA

A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Isolasi merupakan pemishan materi dari materi lain untuk di identifikasi. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging. Pada kali ini kita bahan isolasi DNA tanaman. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandungn protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel.
Salak (Salacca zalacca (Gaertner (Voss) merupakan tanaman asli Indonesia. Buahnya banyak digemari masyarakat karena rasanya manis, renyah dan kandungan gizi yang tinggi. Salak mempunyai nilai ekonomis dan peluang pasar yang cukup luas, baik di dalam negeri maupun ekspor. Pulau Jawa sebagai salah satu pusat keragaman kultivar salak, mempunyai potensi yang cukup besar untuk menghasilkan varietas-varietas unggul yang lebih bernilai ekonomis dan kompetitif. Pusat keragaman genetik yang ada di pulau Jawa meliputi: Condet (Jakarta), Manonjaya (Tasikmalaya- Jawa Barat), Banjarnegara, Bejalen, Saratan, Njagan, Lawu (Jawa Tengah), Sleman (Yogyakarta), Malang, Pasuruan dan Madura (Jawa Timur) (Sudaryono dkk, 1992). Keragaman varietas akan terus berkembang sejalan dengan sistim perkembangbiakan salak secara kawin silang dan penggunaan biji sebagai bahan tanaman. Namun informasi tentang keragaman genetik salak masih sangat kurang. Sehingga perlu adanya isolasi DNA untuk dilakukan pengujian dan penelitian yang merupakan tahap awal di mulainya rekayasa genetika tanaman.
Maka pada praktikum kali ini mencoba untuk mengisolasi DNA dari tanaman Salak. Isolasi DNA salak dengan mengambil potongna daun muda kemudian di ekstraksi dan di dapatkan DNA dari tanaman Salak. Kemudian selanjutnya di identifikasi DNA tersebut.
2. Tujuan
Pada praktikum Bioteknologi Acara 1 Isolasi DNA bertujuan untuk melakukan isolasi DNA Salak dengan metode ekstraksi untuk mendapatkan DNA dari tanaman Salak.
3. Waktu dan Tempat Praktikum
Pada praktikum Bioteknologi Acara I Isolasi DNA dilaksanakan pada tanggal 22 Desember 2010 pukul 15.00 di Laboratorim Pemuliaan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. Tinjauan Pustaka
Penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA (Lamadji 1998), yang sering disebut sebagai penanda molekuler. Penanda molekuler berperan penting dalam konservasi dan pengelolaan sumber daya genetik tanaman (Karp et al. 1997).
Untuk memudahkan penghancuran sampel dari bahan seperti ini, umumnya ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair. Namun, masalah akan muncul bila lokasi penelitian jauh dari pusat industri sehingga sulit mendapatkan nitrogen cair. Oleh karena itu, perlu metode isolasi DNA yang mudah dan tidak memerlukan nitrogen cair, tetapi dapat menghasilkan DNA yang berkualitas tinggi untuk proses amplifikasi (Imran, 2002).
Protokol yang digunakan merupakan prosedur ekstraksi berbasis CTAB yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1987) dan dimodifikasi oleh Santoso (2005), serta dilaksanakan secara preparasi mini. Contoh daun dikeluarkan dari freezer dan ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletakkan dalam mortar pestel dan ditambah 0,5 ml bufer ekstraksi CTAB (CTAB: 4,1 g NaCl, 10 g CTAB, 0,5 M EDTA pH 8,0 (Sumiati, 2009).
Ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisis dinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudian ditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl dan EDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan penghangatan pada suhu 65°C. Detergen seperti sodium dodecil sulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untuk proses lisis (Subandri, 2006).
Penggunaan bufer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang ditunjukkan oleh pita DNA genom Dengan demikian, bufer CTAB dapat digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman jeruk. Produk ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi menggunakan image gel elektroforesis (Anonim, 2008).
Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yaitu teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah 2006).





C. Alat, Bahan, Cara Kerja
1. Alat
a. Sentrifuse h. Petridish
b. Mikropipet i. Erlemenyer
c. Ependorf j. Inkubator
d. Water bath k. Pinset
e. Mortar
f. Timbangan
g. Thermometer

2. Bahan
a. Daun Salak f. Etanol 70 %
b. Larutan Stok g. DNA Loading
c. Chlorofoam h. Agarase
d. 2,5 Sodium asetat i. TAE
e. Aquadest
3. Cara Kerja
1. Sebelum di gunkanan memanaskan buffer ekstraksi dalam suhu 65 0C selama 15-30 menit
2. Menimbang sampel daun seberat 100-150 mg.
3. Melumatkan menjadi tepung halus dengan mortir menggunakan Nitogen cair.
4. Memindahkan tepung yang telah halus dalam tabung steril.
5. Menambahkan 1 ml larutan ekstraksi dan diinkubasi pada suhu 65 0C selama 60 menit.
6. Menambahkan 800 µl chlorofoam mencampurnya hingga homogeny
7. Mencentrifugasi pada kecapatan 12.000 RPM selama 10 menit
8. Mengambil cairan lapisan atas memindahkannya ke tabung baru.
9. Menambahkan 1/10 dari volume 2,5 M Sodium Asetat, dan 650 µl (minimal 1 : 1 dengan volume ) Isopropanol dingin mencampur hingga homogeny kemudian mencentrifugasi pada kecepatan 13.000 RPM selama 5 menit.
10. Membuang supernatant pellet di cuci dengan alcohol 70 %.
11. Mengeringkan pellet DNA dengan kering angin (Centrifuge MILLI-DRY seperlunya).
12. Melarutkan DNA 200 µl TE, Menghitung konsentrasi DNA dengan Spektrofotometer OD 260 dan 280.
13. Menympannya dalam suhu -20 0C.

D. Hasil Dan Pembahasan
1. Hasil

Gambar 1.1. Alat Sentrifuse

Gambar 1.2 Mikropipet

Gambar 1.3 Bahan Yang Akan Diisolasi DNAnya



Gambar 1.4 Ependorf

Gambar 1.5 Sentrifuse Bagian Dalamnya
2. Pembahasan
Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.
Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme.
Pengujian DNA dilakukan untuk mendapatkan genetik tanaman yang unggul sesuai dengan yang kita inginkan. Sehingga bermangaat bagi kehidupan manusia. Pengujian DNA biasanya dilakukan untuk dalam bidang pertanian ntuk mendapat kan tanaman yang tahan dan resisten terhadap hama dan penyakit tanaman
Pengujian DNA adalah suatu teknik biologi molekular yang dipakai untuk kepentingan pengujian forensik terhadap materi uji berdasarkan profil DNA-nya. Teknik ini dikenal pula sebagai penyidikan DNA, penyidikjarian genetik (genetic fingerprinting, sering disingkat sidik jari DNA), DNA profiling, atau semacamnya. Dalam bidang hukum, materi uji hampir pasti adalah ekstrak dari tubuh manusia, misalnya dalam penentuan orang tua atau penyelidikan pemerkosaan/pembunuhan. Namun demikian, penerapan teknik ini juga dipakai untuk hewan maupun tumbuhan, misalnya dalam menentukan kemurnian suatu galur atau kultivar, atau dalam menguji masuknya materi genetik tertentu (misalnya dalam mendeteksi materi transgenik) ke dalam populasi/bahan makanan.
Pengujian DNA memanfaatkan profil DNA, yaitu sehimpunan data yang menggambarkan susunan DNA yang dianggap khas untuk individu yang menjadi sampelnya. Dalam pengujian DNA, hanya sebagian kecil berkas DNA yang dipakai untuk pengujian. Sasaran utama adalah bagian DNA yang berisi pengulangan urutan basa, suatu bagian DNA yang dikenal sebagai pengulangan berurutan yang bervariasi (variable number tandem repeats, VNTR). VNTR dapat berupa minisatelit maupun mikrosatelit. Dengan demikian, pengujian DNA adalah salah satu teknik penggunaan penanda genetik. Karena menggunakan penanda, pengujian DNA bukanlah teknik sekuensing genom menyeluruh (full genome sequencing), yang sering juga disebut dalam literatur sebagai DNA profiling.
Metode pengujian ini pertama kali dilaporkan pada publikasi 1984 oleh Sir Alec Jeffreys dari Universitas Leicester, Inggris; konon penemuannya terjadi secara kebetulan. Teknik ini dikomersialkan pada tahun 1987 ketika ICI membuka pusat pengujian DNA di Inggris. Metode ini sekarang menjadi prosedur forensik rutin di banyak negara.
Pada isolasi DNA menggunakan daun muda atau pucuk jal ini disebabkan bahwa di daun pucuk dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan keberghasilan untu melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.
Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan ekstraksi DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan enzim penghambat-polisakarida.
Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang adalah penggerusan atau homogenasi daun Salak dengan penambahan nitrogen cair. Fungsinya adalah untuk mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan. Hal ini dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur. Selanjutnya dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan nitrogen cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak.
Kemudian dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60 derajat C selama 60 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa supernatan berwarna hijau sedangkan pelet berwarna putih kehijauan.
Supernatan yang telah diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan larutan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Setelah pencampuran, homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi homogenasi.
Selanjutnya dilakukan sentrifugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan kecepatan 13000 rpm selama 5 menit dalam. Hasil yang didapatkan adalah supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian diambil supernatan pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform:Isoamyl Alkohol untuk presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi.
Hasil yang didapatkan akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf, kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan ditambahkan dengan amonium nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan menghilangkan kontaminan. Hasilnya diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam larutan jernih tersebut. Kemudian dilakukan inkubasi selama satu malam untuk optimalisasi presipitasi.
Funsdi alat-alat isolasi DNA. Sentrifuse berfungsi memisahkan antara bagian yang padat dan cair (supernatant dan debsis). Mikropipet berfungsi untuk mengambil larutan supernatant dan zat kimia lain. Ependorf berfungsi untuk wadah sampel yang akan di ekstraksi Water bath berfungsi untuk memanaskan DNA sampel. Mortir berfungsi untuk menghaluskan sampel yang kan di ekstraksi. Timbangan berfungsi untuk menimbang jumlah sampel yang dibutuhkan. Thermometer berfungsi untuk mengukur suhu. Petridish berfungsi untuk membersihkan sampel.. Erlemenyer berfungsi untuk mencairkan agarase. Incubator berfungsi untuk inkubasi sampel. Pinset berfungsi untuk mengambil material kecil. Sarung tangan berfungsi untuk melindungi tangan dari zat berbahaya

E. Kesimpulan Dan Saran
1. Kesimpulan
a. Pengujian DNA dilakukan untuk mendapatkan genetik tanaman yang unggul sesuai dengan yang kita inginkan.
b. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara.
c. Hasil yang didapatkan akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf.
d. Hasil isolasi DNA berupa supernatan dan cairan bening.
2. Saran
Praktikumnya lebih terkonsep yang jelas lagi.