Isolasi dan Karakterisasi Bakteri yang Berasosiasi dengan Kultur Cymbidium dan Pengaruhnya pada Kultur Jaringan Dendrobium hibrida

A. PENDAHULUAN Arti Kata Tissue Culture Sel dianggap kesatuan hidup terkecil dalam makhluk hidup atau suatu kesatuan biologis yang terkecil yang mempunyai kemampuan mengadakan segala aktivitas yang berhubungan dengan proses- proses hidup seperti metabolisme, tumbuh, berkembang, berkembangbiak, dan perangsangan. Tissue atau jaringan merupakan sekumpulan sel- sel yang memiliki bentuk dan fungsi yang sama, namun ada sekelompok sel- sel tertentu memiliki bentuk yang sama berfungsi untuk memperbanyak diri terus menerus dengan membelah diri, sekumpulan sel tersebut diatas namakan jaringan meristem yang terutama bertanggung jawab atas pertumbuhan tanaman. Tissue culture berasal dari kata tissue yang berarti jaringan, dan culture artinya budaya, atau pemeliharaan sehingga arti keseluruhan merupakan budaya jaringan mampu memelihara jaringan. Misalnya akar pada tanaman tomat sepanjang 1 cm ditumbuhakan pada media, tetapi tidak tumbuh menjadi tanaman, hanya memanjang saja, tetapi tetap berupa akar. Tissue culture mendasarkan suatu konsep dari Schleiden Schwann tentang ada atau tidaknya totipotensi pada sel. Totipotensi artinya teoritis dari mana saja, sel itu diambil asal masih muda dan hidup akan mampu tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Beda Meristem Culture dan Tissue Culture Pada meristem culture prinsipnya menanam sebuah jaringan meristem, yang hasilnya nanti menjadi sebuah tanaman atau beberapa tanaman sajayang tidak banyak jumlahnya. Lain halnya dengan tissue culture, yakni berprinsip menanam sebuah jaringanmeristem, yang hasilnya nanti berates- ratus. Penggunaan Tissue Culture Tissue Culture merupakan teknologi bagi beberapa jenis tanaman anggrek. Tidak dapat disangkal lagi bahwa tissue culture mampu memperbanyak tanaman secara vegetative dan besar dengan cara ini. Pembuatan tanaman bebas dari penyakit virus yang telah berhasil dikerjakan oleh (Teo,et al.1960). Pada suatu tanaman Cymbidium yang terserang penyakit virus ternyata titik tumbuhnya yang sedang aktif membelah dan memanjang masih bebas dari penyakit virus. Tissue culture terhadap bagian- bagian tanaman ini menghasilkan tanaman- tanaman yang bebas dari penyakit dan virus. Prinsip Dasar  Tissue Culture merupakan suatu perbanyakan vegetative dengan mengambil suatu jaringan lebih kurang 1-5 mm3 dan mengembangkannya menjadi beribu-ribu, bahkan dapat menjadi beberapa juta tanaman  Tissue culture dikerjakan menurut prinsip suci hama seperti di dalam memelihara mikroorganisme.  Hasil tissue culture yang dicapai, dinamakan mericlone, asal dari kata- kata clone yang dicapai dari budaya meristem, suksesnya tissue culture terletak dalam perbanyakan vegetative secara besar- besaran pada tanaman unggul seperti apa yang dikehendaki  Problema tissue culture ialah membuat regenerasi bagian tanaman yang sangat kecil. Di sini yang dimaksud regenerasi ialah memacu sel- sel tanaman dewasa untuk mendiferensiasikan diri. Pertama- tama menjadi meristem baru dan berikutnya mampu mnuju kea rah organ- organ seperti akr, tunas, daun dsb. Langkah- Langkah Dasar yang Perlu Dikerjakan  Mempersiapkan diri untuk tissue culture i. Organisasi Laboratorium Perlu diperhatikan, sebagai syarat mutlak adalah kebersihan laboratorium dalam arti kata selalu dalam keadaan aseptik. Laboratorium dalam garis besarnya dapat dibagi- bagi dalam ruang- ruang terpisah antara lain: - Tempat penyimpanan zat kimia - Tempat membuat media - Tempat seeding - Tempat inkubator - Tempat almari penabur atau ent-kas - Kamar(tempat alat penggojog  Membersihkan alat- alat dari gelas Botol- botol , elememeyer, petridish, atau piring- piring petri lain yang akan digunakan perlu dibersihkan terlebih dahulu. Pembersihan dilakukan dengan zat- zat kimia, dengan adanya detergent sekarang, campuran asam chromat, dan asam sulfat dapat diganti oleh detergent. Asam chromat dan asam sulfat digunakan untuk membersihkan kotoran yang melekat.  Sterilisasi alat- alat dari gelas Sterilisasi dengan memakai udara panas dapat dilakukan dengan alat yang dinamakan Hot Air Sterilization untuk mensterilkan alat- alat yang terbuat dari gelas, namun dapat pula alat yang terbuat dari bahan logam. Di Indonesia, untuk sterilisasi gelas menggunakan autoklaf buatan dalam negeri.  Mempersiapkan media atau alas makanan Media merupakan senyawa- senyawa anorganikmaupun organikyang dipergunakan untuk pertumbuhan tanaman dengan syarat- syarat tertentu Dalam pembuatan media yang perlu diperhatikan adalah - Unsur- unsur makro Penggunaan unsur- unsur makro banyak variasinya, tetapi dalam kebanyakan hal untuk menyusun C,H,dan O digunakan gula sukrosa Murashige dan Skoog menggunakan campuran nitrat dan ammonium, sedangkan lain peneliti mempergunakan nitrat atau ammonium saja. - Unsur- unsur mikro Unsur – unsur mikro yang seringkali digunakan oleh beberapa peneliti ialah Mn dalam bentuk MnSO4, 4H2O, ada pula Zn dalam bentuk ZnSO4, 7H2O dsb. - Suplement Pada tissue culture, terkadang dibutuhkan zat- zat spesifik untuk memungkinkan jaringan tersebut dapat tumbuh seperti apa yang dikehendaki. Dalam hal ini, media atau alas makanan diberikan tambahan persenyawaan, misalnya asam amino, glycine 3 mg/l, cystein 0,1- 10 mg/l - Zat- zat tumbuh Pada jaringan yang masih perlu dipacu dengan zat hormone kerap kali juga pada media kerapkali ditambah dengan extract zat- zat organik yang maksudnya menginput zat tumbuh. Misalnua 0,5 % yeast ekstrak, air kelapa 15 %, ekstrak tauge 200g/l, dsb Hormon yang kerap kali dipakai ialah auksin atau yang sering dinamankan related growth system seperti NAA, IAA, dan 2,4 Dichlorpenoxyacetic (2-4 D) - Chelating agent Pada waktu media dibuat, tentu saja pH dapat diukur dan disesuaikan dengan mudah Proses tissue culture berjalan 1-3 bulan sebelum dipindahkan. Tergantung cara menyimpan, iklim, temperature, kelembaban ruang, pH dapat berubah dengan cepat atau lambat. Dengan perubahan Ph misalnya dengan naiknya pH maka ferri mengendap dan sukar untuk diserap atau di asimilasi, melihat keadaan tersebut chelating agent sangat diperlukan sebagai penyedia unsur besi sebagai (Fe NA EDTA) sehingga dapat dipastikan bahwa besi adalah dalam jangkauan suatu range pH yang lebih luas dalam waktu yang agak lama. Perbanyakan anggrek di Indonesia, Thailand, Singapura, Taiwan, maupun di Eropa telah menggunakan system perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan. Prakash et al. (1996) menyatakan bahwa sistem kultur dengan sayatan tipis dikombinasikan dengan ribavirin memberikan tanaman anggrek yang bebas virus.Marino et al. (1996) menyatakan bahwa kultur apricot kultivar San Castrese yang dikontaminasi Bacillus circulans dan Sphingomonas paucimobilis, dan kultur aprikot kultivar Portici yang dikontaminasi Staphylococcus hominis dan Micrococcus kristinae menurunkan kecepatan proliferasi dan bobot tunas. Anggapan umum yang menyatakan bahwa kontaminasi bakteri pada kultur dapat menghambat dan bahkan mematikan kultur tidak semuanya benar, di antaranya ada juga yang membantu pertumbuhan kultur. Bums dan Schwarz (1996) menyatakan bahwa kultur pinus yang dikontaminasi bakteri tertentu dapat meningkatkan jumlah akar sebanyak 90%. Plantlet tebu C266-70 yang diinokulasi dengan Azospirillum sp. memberikan peningkatan bobot dan tinggi plantlet masing-masing sebesar 49.9% dan 42.5% (Gonzales et al. 1995). Gosal et al. (1990) menyatakan bahwa A. lipoferum dapat membantu pertumbuhan kalus tebu. Seiring dengan perubahan orientasi dalam bidang pertanian, saat ini terdapat kecenderungan untuk memanfaatkan mikroorganisme sebagai biokontrol maupun sebagai pupuk hayati maka selayaknya bakteri yang menguntungkan pertumbuhan tanaman dan berasosiasi dengan kultur anggrek mendapat perhatian yang serius. B. ISI a. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi sejumlah bakteri dari kultur in vitro Cymbidium dan mengamati pengaruhnya terhadap kultur in vitro Dendrobium. Profil genetika isolate bakteri dilakukan dengan teknik PCR-RFLP dari gen 16SrRNA. Pada penelitian ini diajukan hipotesis yaitu bakteri yang terdapat pada kultur Cymbidium merupakan mikrobiota normal yang menjadi bagian integral dari tanaman dan berperan penting dalam meningkatkan vigor atau keberhasilan kultur jaringan anggrek. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi untuk mengurangi penggunaan zat pengatur tumbuh dalam kultur jaringan dengan memherikan suspensi bakteri tertentu dan informasi tambahan tentang jenis bakteri yang bermanfaat untuk keberhasilan atau peningkatan vigor kultur jaringan anggrek. b. Bahan dan Metode Isolasi Bakteri yang Berasosiasi dengan Kultur Cymbidium. Bakteri diisolasi dari kultur in vitro Cymbidium yang medianya berwarna merah keruh dan putih. Sebanyak 25 J/l cairan media kultur anggrek disebar pada media King's B 25% dan diinkubasi pada suhu kamar selama 48 jam. Selanjutnya koloni tunggal dimurnikan dengan metode gores kuadran dan disimpan dalam gliserol15% pada suhu -800ºC. Analisis PCR-RFLP gen 16S-rRNA. Bakteri hasil isolasi dari kultur Cymbidium dianalisis gen 16S-rRNAnya dengan teknik PCR-RFLP. Analisis molekuler dilakukan dengan tahapan: (i) Isolasi DNA kromosom bakteri dilakukan menggunakan kit Iso- quick (Orca Research, USA). (ii)Ampliflkasi gen penyandi 16S-rRNA dengan kit PCR ReadyTo-Go, PCR Beads (Pharmacia Biotech, Swedia) menggunakan universal primer spesiflk prokariota yaitu: 63f(5'CAGGCCTAACACATGCAAGTC) dan 1387r (5'GGGCGGWGTGTACAAGGC)(Marchesi et al. 1998). ProtokolPeR yang digunakan ialah Pre-PCR (940 selama 2 menit), denaturasi (920 selama 30 detik), annealing atau pelekatan primer (55°C, 30 detik), pemanjangan primer (750 selama I menit). Proses ini dilakukan sebanyak 30 siklus dan dilanjutkan dengan postPCR (750 selama 5 menit); (iii) restriction fragment length polymorphism (RFLP): Sebanyak 14.5 akuabides steril dimasukkan ke dalam eppendorp steril, kemudian berturut-turut ditambahkan bufer enzim yang digunakan, DNA hasil PCR, dan (4 unit) enzim Rsal atau (10 unit) enzim HhaI. Campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama semalam. Elektroforesis dilakukan pada gel agarosa 2% di dalam bufer IxT AE dengan tegangan listrik 50 volt (Sambrooket aI. 1989). Analisis RFLP dilakukan dengan membandingkan fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan produk PCR (gen 16S-rRNA) menggunakan enzim RsaI atau Hhal. Selain analisis molekuler terhadap gen 16S-rRNA, uji fisiologi dilakukan dengan menggunakan kit Microbact (Medvet Science, Australia). Inokulasi bakteri pada kultur jaringan anggrek. Bakteri yang diisolasi dari kultur in vitro anggrek dan control yang terdiri alas bakteri Escherichia coli DHSa dan buffer fosfat diinokulasikan ke kultur in vitro anggrek Dendrobium dengan cara merendam eksplan ke dalam suspensi bakteri (kepekatan 10'-106 seVml) selama 10 menit. Percobaan dirancang menurut rancangan acak lengkap pola faktorial yang diulang tiga kali. Faktor pertama ialah jenis eksplan yang terdiri alas protocorm like bodies (plbs) dan tunas, factor kedua ialah bakteri yang diisolasi dari Cymbidium sp., AE (E.coli DHSa), dan AB (bufer fosfat). Eksplan yang sudah diinokulasi bakteri ditanam dalam bolol kultur, setiap botol diisi tiga eksplan. Kultur dipclihara di ruang pemeliharaan yang diberi penyinaran dengan sinar lampu neon 20 watt(Gunawan 1992). Pengujian hipersensitivitas mengikuti metode LeIliot dan Stead (1987). Bakteri yang digunakan yaitu isolat dari kultur in vitro Cymbidium, Pseudomonas syringae Cit7 sebagai kontrol positif, dan E. coli DHSa sebagai kontrol negatif.Koloni bakteri dari media padat disuspensikan dalam larutan 0.08% garam fisiologi steril dengan kepekatan sekitar 106 seVml kemudian diinjeksikan menggunakan syringe hypodermal yang sterH ke dalam mesofil daun tembakau. Selanjutnya tanaman tembakau yang telah diinokulasi dengan bakteri tersebut diinkubasi selama 16-24 jam pada suhu 28-300c. Analisis Vigor. Untuk mengetahui respons kultur in vitro Dendrobium terhadap perlakuan inokulasi bakteri dilakukan pengamatan setelah berumur dua bulan. Peubah yang diamati yaitu jumlah akar, jumlah anakan~ dan bobot kering total, yang selanjutnya dilakukan analisis keragaman. Data yang diperoleh merupakan rata-rata dari tiga kali ulangan. c. Hasil dan Pembahasan Isolasi dan Karakterisasi BakterL Enam isolat bakteri yang diperoleh dari kultur in vitro Cymbidium sp. yaitu AI, A2, A3, AS, A71, dan A72. Isolat A71 dan A72 berwama putih dan mukoid. sedangkan isolat lainnya berwarna kuning tidak mukoid. Semua isolat bakteri ini memiliki bentuk batang dan termasuk Gram negatif. Analisis PCR-RFLP. Analisis PCR menggunakan primer universal 63f dan 1387r yang spesifik untuk prokariota menghasilkan ukuran fragmen DNA penyandi gen 16S-rRNA sebesar 1.324 kb. Pemotongan gen 16S-rRNA dengan enzim RsaI menghasilkan tiga sampai empat pita untuk tiap-tiap isolate bakteri, sedangkan bila menggunakan enzim HhaI dihasiIkan empat sampai lima pita. Dendrogram kekerabatan berdasarkan prom RFLP gen 16SrRNA setelah dipotong dengan RsaI atau HhaI ditunjukkanpada. Ada tiga kelompok bakteri yang diisolasi dari kultur in vitro Cymbidium yaitu kelompok 1 terdiri alas bakteri isolat AI. A3 dan AS; kelompok 2 terdiri alas isolat A2; dan kelompok 3 terdiri atas isolat A 71 dan A 72. Isolat bakteri A I. A3, dan A5 memiliki jarak genetika 0.79 terhadap A2. sedangkan jarak genetika antara A2 dan A 71, A2 dan A 72 sebesar 0.83 Gambar 1. Profil RFLP I6S-rRNA produk PCR bakteri dari Cymbidiwn: a.pemotongan dengan enzim RsaI. b. pemotongan dcogan enzim HhaI (bp = base pair. M = penanda ukuran molekul DNA. AI. A2 .......... A7 berturut-turut adalah jenis isolat bakteri dari kultur in vitro Cymbidiwn). Gambar 2. Dendrogram hubungan kekerabatan bakteri dari Cymbidium berdasarkan profil RFLP gen 16S-rRNA setelah dipotong dengan Rsal atau Hha!. Angka pada sumbu horizontal menunjukkan % kesarnaan berdasarkan koefisien Jaccard. Uji Hipersensitivitas. Hasil uji hipersensitivitas menunjukkan Lahwa semua bakteri isolat dari kultur in vitro Cymbidium dan E. coli DH5a tidak mematikanjaringan daun tembakau (hipersensitivitas negatit), keeuali P. syringae Cit7 mematikanjaringan daun tembakau (hipersensitivitas positit) Analisis Vigor. Inokulasi bakteri, keeuali isolat A2 yang mematikan kultur Dendrobium, memberikan penampilan pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan dengan control E. coli DH5a dan kontrol bufer fosfat. Lumlah akar dan jumlah anakan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata pada semua perlakuan yang dicobakan. Bobot kering total tertinggi diperoleh pada eksplan tunas dengan perlakuan isolat bakteri A3 dan AS yaitu sebesar 58 dan 59 mg. Analisis data menunjukkan bahwa perlakuan bakteri isolat A3 atau A5 pada eksplan tunas meningkatkan bobotkering sedikitnya 200% bila dibandingkan dengan kontrol, yaitu eksplan tunas atau plbs yang hanya diberi bufer fosfatatau suspensi balCteri E. coli DHSa d. Pembahasan Isolasi dan Karakterisasi Bakteri. Isolat bakteri AI, A2,A3, AS, A71, dan A72 merupakan bakteri yang berasosiasi dengan Cymbidium dan kemungkinan terdapat dalam jaringan Pada kolom yang sarna, angka-angka yang diikuti oleh huruf yang saran tidak berbeda nyata (P>()'05). *Data telah ditransforrnasi ke logaritrna. tanaman sehingga sewaktu-waktu muneul sebagai kontaminan dalam kultur. Atlas dan Bartha (1992) menyatakan organ tanaman seperti akar, batang, daun, dan buah menyediakan habitat yang coeok bagi mikrob epifit. Kenyataan ini menyebabkan sulitnya perlakuan desinfeksi yang merupakan salah satu faktor prinsip dalam kultur jaringan untuk memperoleh eksplan yang steril. Wilkinson et aI. (1994a) juga menemukan 12 spesies bakteri yang berasosiasi dengan tanaman anggrek di Australia Barat. Hasil uji fisiologi dengan kit Microbact (tidak dipublikasikan) kurang dapat dipakai untuk menentukan jenis bakteri sampai tingkat spesies karena beberapa bakteri yang berbeda dapat menunjukkan hasil uji fisiologi yang sarna. Selain itu kit diagnostik ini diraneang terutama untuk identifikasi bakteri asal klinis. Holt et al. (1994) mengemukakan salah satu kesulitan dalam identifikasi ialah hasil uji karakterisasi fisiologi dapat beibeda-beda bergantung pada ukuran inokulum, suhu inkubasi, lama inkubasi, komposisi media, perbandingan volume terhadap permukaan media, dan kriteria yang digunakan untuk mendefinisikan reaksi positif dan negatif. Meskipun demikian, pengujian ini dapat digunakan untuk memperoleh informasi awal tentang sifat fisiologi suatu isolat bakteri. Pemotongan gen 16S-rRNA dengan enzim RsaI menghasilkan fragmen DNA lebih banyak bila dibandingkan dengan pemotongan menggunakan HhaI untuk liap-tiap isolate bakteri. Perbedaan jumlah fragmen DNA ini menunjukkan bahwa pada gen 16S-rRNA bakteri-bakteri tersebut lebih banyak mengandung situs pemotongan enzim HhaI (5'-GCJ, GC) dibandingkan dengan situs pemotongan enzim RsaI (5'-GT J, AC) dan kemungkinan urutan susunan nukleotida pada gen 16S-rRNA lebih banyak terdiri atas G+c. Susunan nukleotida pada gen 16S-rRNA dapat menunjukkan hubungan kekerabatan antara isolat satu dengan isolat lainnya. Semakin mirip susunan nukleotida tersebut maka semakin dekat hubungan kekerabatannya, sebaliknya bila semakin tidak mirip susunan nukleotida tersebut maka semakin jauh hubungan kekerabatannya. Jadi, isolat bakteri dalam kelompok yang sarna memiliki jarak genetika yang lebih dekat dibandingkan isolat bakteri kelompok lain. Pengaruh Inokulasi Bakteri pada Anggrek. Pengaruh positif perlakuan isolat A3 maupun A5 pada eksplan tunas pada harnpir semua peubah yang diarnati diduga disebabkan karena isolat bakteri A3 maupun A5 memiliki triptofan deaminase yang dapat mempengaruhi regulasi sintesis indole-3-acetic acid (IAA). Selanjutnya IAA mempengaruhi perkembangan kultur in vitro Dendrobium dengan merangsang aktivitas sel sehingga pembelahan dan pertumbuhan sel meningkat. Meningkatnya aktivitas sel akan menyebabkan pembentukan organ tanaman -seperti akar, batang, dan daun- meningkat. Semua eksplan tunas memperlihatkan terbentuknya akar sedangkan eksplan plbs tidak membentuk akar. Hal ini mungkin karena plbs cenderung mengalami muCtiplikasi sedangkan eksplan tunas sudah mengalarni morfogenesis sempuma sehingga morfogenesis berikutnya untuk pembentukan akar menjadi lebih mudah Jadi, inokulasi bakteri belum mampu merangsang terbentuknya akar pada plbs Dendrobium, namun hanya marnpu meningkatkan pembentukan akar pada kultur tunas Dendrobium. Pembentukan akar tidak berbeda nyata pada semua perlakuan, meskipun beberapa penelitian menunjukkan bahwa bakteri-bakteri tertentU dapat merangsang pertumbuhan secara langsung melalui sintesis senyawa yang membantu penyerapan nutrien dari lingkungan (Glick et al. 1999), sintesis asarn indol asetat dan giberelin (Wilkinson et al. 1994b). Banyaknya nutrisi yang diserap dan meningkatnya jumlah daun akan memacu laju fotosintesis. Dengan demikian pertumbuhan tanaman akan meningkat. Meningkatnya pertumbuhan tanarnan akan menyebabkan bobot kering yang tinggi sebagaimana terjadi pada perlakuan bakteri A3 atau A5. Rendahnya pengaruh perlakuan E. coli DHSa dan buffer fosfat pada eksplan disebabkan tidak ada tambahan senyawa ke dalarn media yang dapat membantu pertumbuhan kultur eksplan. Bakteri E. coli DHSa. tidak termasuk golongan plant growth-promoting rhizobacteria sehingga diharapkan tidak mensintesis senyawa yang membantu pertumbuhan kultur eksplan. DAFTAR PUSTAKA Atlas RM. Bartha R. 1992. Microbial Ecology: Fundamental andAplications. Ed ke-3. Singapore: Benjamin/Cummings. Bums lA. Schwarz 01. 1996. Bacterial stimulation of adventitious rooting on in vitro cultured slash pine (Pinus elliottii Engelm.) seedling explants. Plant Cell Reports 15:405-408. Glick BR. Patten CL. Holguin G, Panrose DM. 1999. Biochemical and Genetic Mechanisms Used by Plant Growth Promoting Bacteria. London:Imperial College Pr. Gonzales G. Gonzales I. Moya N. Sosa D. Olivera W. 1995. Effect of inoculation with Azospirillum and three level of nitrogen in sugarcane (Saccharum officinarum) C266-70 in vitro. Pastos-y-Forrajes 18:245-249. Gosal SK. Gupta RP, Gosal SS. 1990. Establishment of association between Azospirillum and non-legum in vitro and plant regeneration. Biology 6:161-165. Gunawan, LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Bogoc Institot Pertanian Bogor, Pusat Antar Universitas Bioteknologi.